Приходько С. И. — научный сотрудник, заведующий лабораторией бактериологии
ул. Пограничная, 32, п. Быково, Московская область, 140150
Prikhodko S. I., Researcher, Head of the Laboratory of Bacteriology
32, Pogranichnaya str., Bykovo, Moscow region, 140150
Писарева И. Н. — научный сотрудник, лаборатория бактериологии
Быково, Московская область
Pisareva I. N., Researcher, Laboratory of Bacteriology
Bykovo, Moscow Region
Корнев К. П. — кандидат биологических наук, заместитель директора
Быково, Московская область
Kornev K. P., PhD (Biol.), Deputy Director
Bykovo, Moscow Region
Возбудитель бактериоза винограда (болезнь Пирса) Xylella fastidiosa — карантинный объект, отсутствующий на территории стран-партнеров Евразийского Экономического Союза. Для проведения эффективной диагностики требуется гармонизация методов с международными и региональными диагностическими протоколами, следует также учитывать необходимость импортозамещения рекомендуемых реагентов. В ходе исследований, проведенных на базе ФГБУ ВНИИКР были оптимизированы 5 ПЦР-тестов с компонентами отечественного производства и определены их основные критерии эффективности согласно стандарту ЕОКЗР 7/098 (4). Дополнительно проведена валидация коммерческого набора «Фитоскрин» (ООО «Синтол», Россия). Результаты оценки применимости показали высокую чувствительность ПЦР-РВ в соответствии с Harper et al. (2010), Li et al. (2013), и Ouyang et al. (2013), которая составила 102 КОЕ/мл, высокую специфичность (не было обнаружено ложноположительных или неспецифичных реакций), а также 100 %-ную в опыте прецизионность в условиях повторяемости и промежуточную прецизионность. Данные тесты войдут в методические рекомендации по диагностике X. fastidiosa как отборочные. Также следует отметить повышение чувствительности ПЦР по Li et al. (2013), с реакционной смесью 5х MasCFЕ TaqMIX -2025 («Диалат Ltd.», Россия) по сравнению с данными, представленными в отчете TPS (2018). Кроме того, установлено, что ПЦР-РВ по Francis et al. (2006) и классическая ПЦР по Minsavage et al. (1994) имеют аналитическую чувствительность 100 % при концентрации целевого объекта 103 КОЕ/мл и 104 КОЕ/мл соответственно. Выявлена селективность всех ПЦР-РВ, кроме коммерческого набора «Фитоскрин» по отношению к экстракту лаванды, который характеризовался ингибированием амплификации.
The grape bacteriosis agent (Pierce disease), namely, Xylella fastidiosa, represents a quarantine disease that is absent on the territory of the Eurasian Economic Union. For its efficient detection, the methods should be harmonised with international and local protocols; the import substitution of the recommended reagents should be considered. Five PCR tests were optimised using domestically produced compounds, and their main efficiency criteria, as per the EPPO standard 7/098 (4), were determined during studies carried out at the FSBI VNIIKR. In addition, a commercial kit, “Phytoscreen” (LLC “Syntol”, Russia), was validated. The results of the applicability assessment revealed a high sensitivity of real-time PCR (102 CFU/ml) following Harper et al. (2010), Li et al. (2013) and Ouyang et al. (2013), high sensitivity (no false positive or non-specific reactions were detected) and 100 % precision in experiment and site precision. These tests will be included in the guidelines for detecting X. fastidiosa as a screening test. It should be noted that the sensitivity of PCR, as per Li et al. (2013), using the 5x MasCFE TaqMIX -2025 reaction mixture (“Dialat Ltd.”, Russia), was improved relative to the data reported in TPS (2018). In addition, real-time PCR based on Francis et al. (2006) and classical PCR, as per Minsavage et al. (1994), exhibit an analytical sensitivity of 100 % at target concentrations of 103 and 104 CFU/ml, respectively. All real-time PCR showed selectivity for lavender extract, excluding the commercial Phytoscreen kit, which was characterised by inhibition of amplification.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.