Сидорова Т. Н. — младший научный сотрудник
проспект Науки, 6, г. Пущино, Московская область,142290
Sidorova T. N., Junior Researcher
6, prospekt Nauki, Pushchino, Moscow region, 142290
Михайлов Р. В. — ведущий специалист ООО «Антерикс»
г. Пущино
Mikhaylov R. V., Key specialist, LLC «Anterix»
Pushchino, Moscow region
Пушин А. С. — младший научный сотрудник
проспект Науки, 6, г. Пущино, Московская область,142290
Pushin A. S., Junior Researcher
6, prospekt Nauki, Pushchino, Moscow region, 142290
Мирошниченко Д. Н. — кандидат биологических наук, старший научный струдник
проспект Науки, 6, г. Пущино, Московская область,142290
Miroshnichenko D. N., PhD (Biol.), Senior Researcher, Chief Researcher
6, prospekt Nauki, Pushchino, Moscow region, 142290
Долгов Сергей Владимирович — доктор биологических наук, главный научный сотрудник
проспект Науки, 6, г. Пущино, Московская область,142290
Sergey V. Dolgov, Dr. Sci. (Biol.), Chief Researcher
6, prospekt Nauki, Pushchino, Moscow region, 142290
Нами разработана эффективная система агробактериальной трансформации эксплантов листьев сливы (Prunus domestica L.) с использованием системы селекции PMI/манноза и GFP. Сорт Стартовая был трансформирован с использованием штамма Agrobacterium tumefaciens CBE21, несущего вектор pNOV35SGFP. Экспланты листьев помещали в питательную среду, содержащую различные концентрации и комбинации маннозы и сахарозы, чтобы разработать эффективную систему селекции. Девять независимых трансгенных линий растений сливы были получены на регенерационной среде, содержащей 20 г/л сахарозы и 15 г/л маннозы. Самая высокая частота трансформации (1,40 %) была получена с использованием стратегии отложенной селекции. Начиная с первых суток после трансформации и заканчивая регенерацией побегов из трансгенного каллуса, отбор трансгенных клеток контролировали по флуоресценции GFP, что позволяло избежать образования нетрансгенных побегов. Интеграцию трансгенов manA и gfp подтверждали с помощью ПЦР и саузерн-блоттинга. В настоящем исследовании не было обнаружено прямой корреляции между уровнем флуоресценции и числом копий трансгенов, хотя наиболее интенсивная флуоресценция наблюдалась в линии № 9 с однокопийной вставкой. Разница в уровне экспрессии GFP могла быть вызвана сайтом интеграции или другими факторами, такими как метилирование ДНК и варьирующееся количество копий. Описанный протокол трансформации с использованием системы PMI/маннозы является альтернативной системой селекции для получения трансгенных растений сливы без генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам, а использование листовых эксплантов позволяет сохранить культурные признаки растений сливы.
We developed an efficient system for agro-bacterial transformation of plum (Prunus domestica L.) leaf explants using the PMI/mannose and GFP selection system. Th e variety `Startovaya` was transformed using Agrobacterium tumefaciens strain CBE21 carrying the vector pNOV35SGFP. Leaf explants were placed onto a nutrient medium containing various concentrations and combinations of mannose and sucrose to develop an efficient selection system. Nine independent transgenic lines of plum plants were obtained on a regeneration medium containing 20 g/L sucrose and 15 g/L mannose. The highest transformation frequency (1.40 %) was produced using a delayed selection strategy. Starting from the 1st days after transformation and ending by regeneration of shoots from the transgenic callus, selection of transgenic cells was monitored by GFP fluorescence that allowed avoid ing formation of escapes. Integration of the manA and gfp transgenes was confi rmed by PCR and Southern blotting. On the whole, no direct correlation between the fluorescence level and the copy numbers of the transgenes was found in the present study, though the most intensive fluorescence was observed in line #9 with a single-copy insert. The difference of GFP expression level may have been caused by the integration site or by other factors such as DNA methylation and varying copy number. The described transformation protocol using a positive PMI/mannose system is an alternative selection system for production of transgenic plum plants without genes of antibiotic and herbicide resistance, and the use of leaf explants enables retention of variety traits of plum plants.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.