vstispСадоводство и виноградарствоHorticulture and viticulture0235-25912618-9003Autonomous non-profit organization Editorial Board of journal «Horticulture and viticulture»10.31676/0235-2591-2022-6-5-15vstisp-948Research ArticleГЕНЕТИКА, СЕЛЕКЦИЯ, СЕМЕНОВОДСТВОGENETICS, BREEDING, SEED PRODUCTIONБиотехнологические и молекулярно-генетические методы в селекции виноградаBiotechnological and molecular genetic methods in grape breedinghttps://orcid.org/0000-0003-3879-0485ЛиховскойВ. В.LikhovskoiV. V.

Лиховской Владимир Владимирович – доктор сельскохозяйственных наук, директор

ул. Кирова, 31, Ялта, Республика Крым, 298600

Vladimir V. Likhovskoi, Dr. Sci. (Agric.), Director

31, Kirova str., Yalta, Republic of Crimea, 298600

lihovskoy@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-3363-8292ЗленкоВ. А.ZlenkoV. A.

Зленко В. А. – кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, ведущий научный сотрудник

Ялта, Республика Крым

Zlenko V. А., PhD. Sci. (Agric.), Assistant Professor, Leading Staff Scientist

Yalta, Republic of Crimea

https://orcid.org/0000-0003-4002-8799ХватковП. А.KhvatkovP. A.

Хватков П. А. – старший научный сотрудник

Ялта, Республика Крым

Khvatkov P. А., Senior Scientist

Yalta, Republic of Crimea

МалетичГ. К.MaletichG. K.

Малетич Г. К. – младший научный сотрудник

Ялта, Республика Крым

Maletich G. К., Junior Scientist

Yalta, Republic of Crimea

https://orcid.org/0000-0001-6725-250XСпотарьГ. Ю.SpotarG. Yu.

Спотарь Г. Ю. – аспирант, младший научный сотрудник

Ялта, Республика Крым

Spotar G. Yu., Postgraduate, Junior Scientist

Yalta, Republic of Crimea

https://orcid.org/0000-0002-5695-5936ЛущайЕ. А.LushchayЕ. А.

Лущай Е. А. – младший научный сотрудник

Ялта, Республика Крым

Lushchay E. А., Junior Staff Scientist

Yalta, Republic of Crimea

https://orcid.org/0000-0002-7452-0776КлименкоВ. П.KlimenkoV. P.

Клименко В. П. – доктор сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник, заведующий Лабораторией генетики, биотехнологий селекции и размножения винограда

Ялта, Республика Крым

Klimenko V. P., Dr. Agric. Sci., Senior Staff Scientist, Head of theLaboratory of Genetics, Biotechnologies of Grape Breeding andReproduction

Yalta, Republic of Crimea

Всероссийский национальный научно-исследовательский институт виноградарства и виноделия «Магарач» РАНРоссияAll-Russian National Research Institute of Viticulture and Winemaking “Magarch” of the Russian Academy of SciencesRussian FederationВсероссийский национальный научно-исследовательский институт виноградарства и виноделия «Магарач» РАН; Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад – Национальный научный центр РАНРоссияAll-Russian National Research Institute of Viticulture and Winemaking “Magarch” of the Russian Academy of Sciences; Nikitskiy Botanical Garden — National Scientific Center of the of the Russian Academy of SciencesRussian Federation20222212202206515Copyright © Autonomous non-profit organization Editorial Board of journal «Horticulture and viticulture», 20222022Autonomous non-profit organization Editorial Board of journal «Horticulture and viticulture»Autonomous non-profit organization Editorial Board of journal «Horticulture and viticulture»https://www.sadivin.com/jour/about/submissions#copyrightNoticehttps://www.sadivin.com/jour/article/view/948

На сегодняшний день одно из самых актуальных направлений в селекции винограда – это создание новых сортов с высокими качественными показателями и устойчивостью к стресс-факторам среды для расширения сортимента и импортозамещения с использованием биотехнологических методов. Вследствие большой гетерогенности сортов винограда методики регенерации растений из проэмбриогенного каллуса путем соматического эмбриогенеза разработаны для незначительного количества генотипов. В результате проведенных исследований с применением культур колхицинированных проэмбриогенных клеточных суспензий и соматических глобулярных эмбриоидов гибридной формы Е-342 в вариантах жидких сред разработана универсальная методология развития глобулярных, сердцевидных и торпедовидных эмбриоидов у различных генотипов винограда. Методология позволяет эффективно улучшать протоколы эмбриогенеза и индукции полиплоидии. Универсальность разработанной методологии индукции полиплоидии и соматического эмбриогенеза у винограда обеспечивается снижением концентрации неорганического азота и витаминов в средах NN и PG в четыре раза и добавлением органического азота и других биологических активных веществ на этапах развития проэмбриогенного каллуса, колхицинирования и развития соматических эмбриоидов в жидких средах. Изучены и освоены методы косвенного анализа плоидности по свойствам эпидермиса листьев винограда. По комплексу четырех признаков предварительно выделено девять перспективных сомаклонов. Установлено, что только способ трансформации, предполагающий получение из листового экспланта эмбриогенного каллуса, пассаж его в жидкую культуру с получением жидкой эмбриокультуры и трансформацию этой культуры позволяет получить полноценные трансгенные растения винограда. Трансформации подвергнуто 300 листовых эксплантов сорта Ливия и 1 100 глобулярных эмбриоидов сорта Подарок Магарача. В результате экспериментов отселектированы три каллусных канамицинустойчивых линий сорта Ливия и шесть линий трансгенных растений сорта Подарок Магарача. По результатам генотипирования по 9 ядерным микросателлитным локусам идентифицированы 7 неизвестных форм с бессемянным фенотипом. При помощи маркеров бессемянности MAS-селекции VMC7f2 и p3_VvAGL11 в популяции гибридных сеянцев выявлены гибриды, имеющие аллели, сцепленные с признаком бессемянности.

The development of new grape varieties with improved quality and resistance against environmental factors using biotechnological methods is a pressing task in the context of import substitution policy implementation. Due to the high heterogeneity of grape varieties, techniques for regenerating plants from embryogenic callus by somatic embryogenesis have been developed only for a small number of genotypes. This work presents a versatile approach to the development of globular, heart, and torpedo embryos in various grape genotypes. Experiments were carried out using cultures of colchicine embryogenic cell suspensions and somatic globular embryos of the E-342 hybrid form in liquid media. The developed methodology allows the protocols of embryogenesis and polyploidy induction to be effectively improved. The versatility of the presented methodology for polyploidy induction and somatic embryogenesis in grape plants is ensured by a fourfold reduction in the concentration of inorganic nitrogen and vitamins in the NN and PG media and the addition of organic nitrogen and other biological active substances at the stages of embryogenic callus development, colchicination, and development of somatic embryoids in liquid media. The methods of indirect ploidy determination by the properties of the grape leaf epidermis were studied and implemented. Nine promising somaclones were preliminary selected based on a set of four features. It was established that full-fledged transgenic grape plants can only be obtained by the method of transformation, which involves the production of embryogenic callus from a leaf explant, its subsequent passage into a liquid culture to obtain a liquid embryo culture, and the transformation of this culture. In total, 300 leaf explants of the Libya variety and 1 100 globular embryos of the Podarok Magaracha variety were transformed. As a result, six callus kanamycin-resistant lines of the Libya variety and six lines of transgenic plants of the Podarok Magaracha variety were selected. Following genotyping based on nine nuclear microsatellite loci, seven unknown forms with a seedless phenotype were identified. Among the population of hybrid seedlings, hybrids having alleles associated with seedlessness were revealed using the VMC7f2 and p3_VvAGL11 MAS markers.

виноградэмбриогенезполиплоидияхлоропластыгенетическая трансформациягенотипированиеMAS-селекциясеквенированиемаркеры SNPgrapesembryogenesispolyploidychloroplastsgenetic transformationgenotypingMAS selectionsequencingSNP markersReferencesКлименко В. П., Павлова И. А. Генетические основы создания сортов винограда при участии источников ценных признаков с низкой фертильностью, «Магарач». Виноградарство и виноделие. 2015:3;47-49.Klimenko V.P., Pavlova I.A. Genetic basis of creating grape varieties with the use of low fertile sources of valuable traits, Magarach. Viticulture and Winemaking. 2015:3;47-49. (In Russ.)Зленко В. А., Лиховской В. В., Волынкин В. А., Хватков П. А., Васылык И. А., Долгов С. В. Индукция соматического эмбриогенеза в культуре in vitro винограда (Vitis vinifera L.) отечественной и зарубежной селекции. Биотехнология. 2017;5:35-44. DOI:10.21519/0234-2758-201733-5-35-44.Zlenko V. A., Likhovskoi V. V., Volynkin V. A., Khvatkov P. A., Vasylyk I. A., Dolgov S. V. Induction of in vitro Somatic Embryogenesis in Grapes (Vitis vinifera L.) of Domestic and Foreign Breeding. Biotechnology. 2017;5:35-44. DOI:10.21519/02342758-2017-33-5-35-44. (In Russ.)Acanda Y., Martinez O., Ganzalez M. U., Prado M.J., Rey M. Highly effi cient in vitro tetraploid plant production via colchicine treatment using embriogenic suspension cultures in grapevine (Vitis vinifera cv. Mencia). Plant Cell Tissue rend Organ Culture. 2015;123:547. DOI:10.1007/s11240-015-0859-3.Acanda Y., Martinez O., Ganzalez M. U., Prado M.J., Rey M. Highly effi cient in vitro tetraploid plant production via colchicine treatment using embriogenic suspension cultures in grapevine (Vitis vinifera cv. Mencia). Plant Cell Tissue rend Organ Culture. 2015;123:547. DOI:10.1007/s11240-015-0859-3.Chen J., Tang X., Ma X., Zhao Q., Dong Z., Li D. Generation of a new polyploidy grape cultivar by a new strategy that combines crossbreeding with colchicine-induced mutation, Program and Abstracts 10th International conference on Grapevine Breeding and Genetics, 1-5 august 2010 Geneva, New York, USA, 2010, 161.Chen J., Tang X., Ma X., Zhao Q., Dong Z., Li D. Generation of a new polyploidy grape cultivar by a new strategy that combines crossbreeding with colchicine-induced mutation, Program and Abstracts 10th International conference on Grapevine Breeding and Genetics, 1-5 august 2010 Geneva, New York, USA, 2010, 161.Решетников В. Н., Спиридович Е. В., Носов А. М. Биотехнология растений и перспективы ее развития. Физиология растений и генетика. 2014;46(1):3-18.Reshetnikov V. N., Spiridovich E. V., Nosov A. M. Biotechnology of plants and prospects for its development. Physiology of plants and genetics. 2014;46(1):3-18. (In Russ.)Скабкин М. А., Скабкина О. В., Овчинников Л. П. Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов. Успехи биол. химии. 2004;44:3-52.Skabkin M. A., Skabkina O. V., Ovchinnikov L. P. Multifunctional proteins with a cold shock domain in the regulation of gene expression. Advances in biological chemistry. 2004;44:3-52. (In Russ.)Рыжова Н. Н., Филюшин М. А., Артемьева А. М., Бердникова М. В., Таранов В. В., Бабаков А. В., Кочиева Е. З. Идентификация и анализ нуклеотидного полиморфизма генов Brassica rapa (репа), кодирующих белки с доменом холодового шока (CSDP). Молекулярная биология. 2013;47(1):107-115.Ryzhova N. N., Filiushin M. A., Artem’eva A. M., Berdnikova M. V., Taranov V. V., Babakov A. V., Kochieva E. Z. Identifi cation and nucleotide polymorphisms in Brassica rapa genes coding cold-shock domain proteins. Molecular biology. 2013;47(1):107115. (In Russ.)Castiglioni P., Warner D., Bensen R. J., Anstrom D. C., Harrison J., Stoecker M., Abad M., Kumar G., Salvador S., D’Ordine R., Navarro S., Back S., Fernandes M., Targolli J., Dasgupta S., Bonin C., Luethy M. H., Heard J. E. Bacterial RNA Chaperones Confer Abiotic Stress Tolerance in Plants and Improved Grain Yield in Maize under Water-Limited Conditions. Plant Physiology. 2008;147:446-455.Castiglioni P., Warner D., Bensen R. J., Anstrom D. C., Harrison J., Stoecker M., Abad M., Kumar G., Salvador S., D’Ordine R., Navarro S., Back S., Fernandes M., Targolli J., Dasgupta S., Bonin C., Luethy M. H., Heard J. E. Bacterial RNA Chaperones Confer Abiotic Stress Tolerance in Plants and Improved Grain Yield in Maize under Water-Limited Conditions. Plant Physiology. 2008;147:446-455.Kim M. H., Sasaki K., Imai R. Cold shock domain protein 3 regulates freezing tolerance in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 2009;284:23454-23460.Kim M. H., Sasaki K., Imai R. Cold shock domain protein 3 regulates freezing tolerance in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 2009;284:23454-23460.Mejía N., Soto B., Guerrero M., Casanueva X., Houel C., Ángeles Miccono M., Ramos R., Cunff L., Boursiquot J.-M., Hinrichsen P., Adam-Blondon A.-F. Molecular, genetic and transcriptional evidence for a role of VvAGL11 in stenospermocarpic seedlessness in grapevine. BMC Plant Biology. 2011;11:57. DOI:10.1186/1471-2229-11-57.Mejía N., Soto B., Guerrero M., Casanueva X., Houel C., Ángeles Miccono M., Ramos R., Cunff L., Boursiquot J.-M., Hinrichsen P., Adam-Blondon A.-F. Molecular, genetic and transcriptional evidence for a role of VvAGL11 in stenospermocarpic seedlessness in grapevine. BMC Plant Biology. 2011;11:57. DOI:10.1186/1471-2229-11-57.Rubio B., Lalanne-Tisné G., Voisin R., Tandonnet J.-P., Portier U., Van Ghelder C., Lafargue M., Petit J.-P., Donnart M., Joubard B. et al. Characterization of Genetic Determinants of the Resistance to Phylloxera, Daktulosphaira Vitifoliae, and the Dagger Nematode Xiphinema Index from Muscadine Background. BMC Plant Biol. 2020;20:213.Rubio B., Lalanne-Tisné G., Voisin R., Tandonnet J.-P., Portier U., Van Ghelder C., Lafargue M., Petit J.-P., Donnart M., Joubard B. et al. Characterization of Genetic Determinants of the Resistance to Phylloxera, Daktulosphaira Vitifoliae, and the Dagger Nematode Xiphinema Index from Muscadine Background. BMC Plant Biol. 2020;20:213.Smith H. M., Clarke C. W., Smith B. P., Carmody B. M., Th omas M. R., Clingeleff er P. R., Powell K. S. Genetic identifi cation of SNP markers linked to a new grape phylloxera resistant locus in Vitis cinerea for marker-assisted selection. BMC Plant Biol. 2018;18:360.Smith H. M., Clarke C. W., Smith B. P., Carmody B. M., Th omas M. R., Clingeleff er P. R., Powell K. S. Genetic identifi cation of SNP markers linked to a new grape phylloxera resistant locus in Vitis cinerea for marker-assisted selection. BMC Plant Biol. 2018;18:360.Vasylyk I., Gorislavets S., Matveikina E., Lushchay E., Lytkin K., Grigoreva E., Karzhaev D., Volkov V., Volodin V., Spotar G. et al. SNPs Associated with Foliar Phylloxera Tolerance in Hybrid Grape Populations Carrying Introgression from Muscadinia. Horticulturae. 2022;8 (16):16. DOI:10.3390/horticulturae8010016.Vasylyk I., Gorislavets S., Matveikina E., Lushchay E., Lytkin K., Grigoreva E., Karzhaev D., Volkov V., Volodin V., Spotar G. et al. SNPs Associated with Foliar Phylloxera Tolerance in Hybrid Grape Populations Carrying Introgression from Muscadinia. Horticulturae. 2022;8 (16):16. DOI:10.3390/horticulturae8010016.Клименко В. П., Лущай Е. А., Абдурашитова А. С. Идентификация уровня плоидности растений в селекции винограда, «Магарач». Виноградарство и виноделие. 2021;23(4):322-329. DOI:10.35547/IM.2021.23.4.003.Klimenko V. P., Lushchay E. A., Abdurashitova A. S. Identifi cation of the ploidy level of plants in grape breeding, Magarach. Viticulture and Winemaking. 2021;23(4):322-329. DOI:10.35547/IM.2021.23.4.003 (In Russ.)Edwards K., Johnstone C., Th ompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis, Nucleic Acids Res. 1991;19:349.Edwards K., Johnstone C., Th ompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis, Nucleic Acids Res. 1991;19:349.Rogers S. O., Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummifi ed plant tissues. Plant molecular biology. 1985;5(2):69-76.Rogers S. O., Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummifi ed plant tissues. Plant molecular biology. 1985;5(2):69-76.This P., Jung A., Boccacci P. et al. Development of a standard set of microsatellite reference alleles for identifi cation of grape cultivar. Theoretical and Applied Genetics. 2004;109(7):1448-1458.This P., Jung A., Boccacci P. et al. Development of a standard set of microsatellite reference alleles for identifi cation of grape cultivar. Th eoretical and Applied Genetics. 2004;109(7):1448-1458.Vitis International Variety Catalogue VIVC. Julius Kuhn-Institut. [Electronic resource]. http://www.vivc.de/index.php. Date of application: 15.05.2022.Vitis International Variety Catalogue VIVC. Julius Kuhn-Institut. [Electronic resource]. http://www.vivc.de/index.php. Date of application: 15.05.2022.Доспехов Б. А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Агропромиздат, 1985, 351 с.Dospekhov B. A. Field experiment methodology (with the basics of statistical processing of research results). M.: Agropromizdat, 1985, 351 p. (In Russ.)

The authors declare that there are no conflicts of interest present.