Создание трансгенной формы подвоя косточковых культур ((Prunus pumila L.×P. salicina Lindl.)×(P. cerasifera Ehrh.)) с использованием конструкции РНК-шпильки (Hairpin-RNA) для устойчивости к потивирусу шарки сливы

Использование подвоев сливы, устойчивых к потивирусу шарки сливы (PPV), является важной стратегией борьбы с распространением заболевания в питомниках и садах. Несмотря на значительный прогресс в разработки подвоев косточковых плодовых культур для адаптации к различным стрессам, долговременная устойчивость к вирусам традиционными методами селекции до сих пор безуспешна. По этой причине создание устойчивых к PPV растений биоинженерными методами остается актуальной в противодействии распространению этого заболевания. Целью настоящего исследования является получение трансгенных растений клонового подвоя косточковых культур `Элита`, устойчивого к PPV, с использованием технологии интерференции рибонуклеиновых кислот (RNAi). Для индуцирования механизма посттранскрипционного замалчивания экспресии генов, обеспечивающий устойчивость к вирусу, была использована генетическая конструкция, содержащая самокомплементарные фрагменты последовательности гена белка оболочки вируса шарки сливы (PPV-CP). Трансгенные растения были получены после опосредованной агробактериями трансформации листьев in vitro. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) и Саузерн-блоттинга подтвердили стабильную геномную интеграцию последовательности PPV-CP смысловой и антисмысловой интрон-РНК-шпильки последовательности. Функциональность введенной экспрессионной кассеты была подтверждена активностью включения гена uidA в переносящую Т-ДНК. Насколько нам известно, это первый межвидовой подвой сливы, полученный с помощью генной инженерии для достижения устойчивости к PPV.

1. Scorza R., Callahan A., Dardick C., Ravelonandro M., Polak J., Malinowski T., Zagrai I., Cambra M., Kamenova I. Genetic engineering of Plum pox virus resistance: `HoneySweet` plum — From concept to product. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2013;115:1-12. DOI: 10.1007/s11240-013-0339-6

2. Llacer G., Cambra. M. Hosts and symptoms of Plum pox virus: Fruiting Prunus species. EPPO Bull. 2006;36:219-221.

3. Cambra M., Capote N., Myrta A., Llacer G. Plum pox virus and the estimated costs associated with sharka disease. Bull. OEPP/EPPO Bull. 2006;36:202-204.

4. IlardiV., Tavazza M. Biotechnological strategies and tools for Plum pox virus resistance: Trans-, intra-, cis-genesis, and beyond. Front. Plant Sci. 2015;6:379. DOI: 0.3389/fpls.2015.00379

5. Rubio M., Pascal T., Bachellez A., Lambert P. Quantitative trait loci analysis of Plum pox virus resistance in Prunus davidiana P1908: New insights on the organization of genomic resistance regions. Tree Genet. Genomes 2010;6:291-304. DOI: 10.1007/s11295-009-0249-2

6. Marandel G., Salava J., Abbott A., Candresse T., Decroocq V. Quantitative trait loci meta-analysis of Plum pox virus resistance in apricot (Prunus armeniaca L.): New insights on the organization and the identifi cation of genomic resistance factors. Mol. Plant Pathol. 2009;10:347-360. DOI:10.1111/J.1364-3703.2009.00535.x

7. Hartmann W., Neumuller M. “Plum breeding,” in Breeding Plantation Tree Crops: Temperate Species; Mohan, J.S., Priyadarshan, P.M., Eds.; Springer: New York, NY, USA, 2009, 161-23. DOI:10.1007/978-0-387-71203-1

8. Scorza R., Ravelonandro M., Callahan A. M., Cordts J. M., Fuchs M., Dunez J., Gonsalves D. Transgenic plum (Prunus domestica L.) express the Plum pox virus coat protein gene. Plant Cell Rep. 1994;14:18-22. DOI: 10.1007/BF00233291

9. Ravelonandro M., Scorza R.; Bachelier J. C., Labonne G., Levy L., Damsteegt V., Callahan A. M., Dunez J. Resistance of transgenic Prunus domestica to plum pox virus infection. Plant Dis. 1997;81:1231-1235.

10. Wang A., Tian L., Brown D. C.W., Svircev A. M., Stobbs L. W., Sanfaçon H. Generation of efficient resistance to Plum pox virus (PPV) in Nicotiana benthamiana and Prunus domestica expressing triple-intron-spanned double-hairpin RNAs simultaneously targeting 5′ and 3′ conserved genomic regions of PPV. Acta Hortic. 2013;1063:77-84.

11. Ravelonandro M., Scorza R., Hily J. M., Briard P. Th e effi ciency of RNA interference for conferring stable resistance to Plum pox virus. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2014;118:347-356. DOI: 10.1007/s11240-014-0487-3

12. Mikhailov R. V., Dolgov S. V. Agrobacterium-mediated transformation of plum cv. Startovaya by selfcomplementary hairpin RNA of PPV-CP gene. Acta Hortic. 2011;941:85-90. DOI: 10.17660/ActaHortic.2012.941.5

13. Sidorova T. N., Vagapova T. I., Dolgov S. V. Intron-hairpin RNA construct provides stable resistance to Plum pox virus in plum cultivar `Startovaja`. Acta Hortic. 2016;1110:197-202. DOI: 10.17660/actahortic.2016.1110.28

14. Lemgo G. N., Sabbadini S., Pandolfi ni T., Mezzetti B. Biosafety considerations of RNAi-mediated virus resistance in fruit-tree cultivars and in rootstock. Transgenic Res. 2013;22:1073- 1088. DOI:10.1007/s11248-013-9728-1

15. Limera C., Sabbadini S., Sweet J. B., Mezzetti B. New biotechnological tools for the genetic improvement of major woody fruit species. Front. Plant Sci. 2017;8:1418. DOI: 10.3389/fpls.2017.01418

16. Zhao D., Song G. Q. Rootstock-to-scion transfer of transgene-derived small interfering RNAs and their eff ect on virus resistance in nontransgenic sweet cherry. Plant Biotechnol. J. 2014;12:1319-1328.

17. Flachowsky H., Trankner C., Szankowski I., Waidmann S., Hanke M., Treutter D., Fischer C. T. RNA-mediated gene silencing signals are not graft transmissible from the rootstock to the scion in greenhouse-grown apple plants malus spp. Int. J. Mol. Sci. 2012;13:9992-10009.

18. Padilla I. M. G.; Burgos L. Aminoglycoside antibiotics: Structure, functions and eff ects on in vitro plant culture and genetic transformation protocols. Plant Cell Rep. 2010;29:1203-1213. DOI: 10.1007/s00299-010-0900-2

19. Sidorova T., Mikhailov R., Pushin A., Miroshnichenko D., Dolgov S. A non-antibiotic selection strategy uses the phosphomannose-isomerase (PMI) gene and green fl uorescent protein (GFP) gene for Agrobacterium-mediated transformation of Prunus domestica L. leaf explants. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2017;128:197-209. DOI: 10.1007/s11240-016-1100-8

20. Lazo G. R., Stein P. A., Ludwig R. A. A DNA transformation competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Nat. Biotechnol. 1991;9:963-967. DOI:10.1038/nbt1091-967

21. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth bio assays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 1962;15:473- 497. DOI:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

22. Jacobini A., Standardi A. La moltiplicazione “in vitro” del melo cv. Wellspur. Riv. Ortofl orofruttic. Ital. 1982;66:217-229.

23. Jeff erson R. A. Assaying chimeric genes in plants: Th e GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 1987;5:387-405.

24. Rogers S., Bendich A. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi. In Plant Molecular Biology Manual; Gelvin, S., Schiperoort, R., Eds.; Springer: Dordrecht, Netherlands. 1994;7(1):183-190.

25. Sidorova T., Mikhailov R., Pushin A., Miroshnichenko D., Dolgov S. Agrobacterium-Mediated Transformation of Russian Commercial Plum cv. Front Plant Sci. 2019;10:286.

26. Meisel Lee, Fonseca Beatriz, Gonzalez Susana, BaezaYates Ricardo. A Rapid and Effi cient Method for Purifying High Quality Total RNA from Peaches (Prunus persica) for Functional Genomics Analyses. Biological Research. February. 2005;38(1):83- 8. DOI:10.4067/S0716-97602005000100010

27. Gambino G., Gribaudo I. Genetic transformation of fruit trees: Current status and remaining challenges. Transgenic Res. 2012;21:1163-1181. DOI: 10.1007/s11248-012-9602-6

28. Dolgov S., Mikhaylov R., Serova T., Shulga O., Firsov A. Pathogen-derived methods for improving resistance of transgenic plums (Prunus domestica L.) for Plum pox virus infection. Julius Kühn Arch. 2010;427:133-140.

29. Padilla I. M., Golis A., Gentile A., Damiano C., Scorza R. Evaluation of transformation in peach Prunus persica explants using green fl uorescent protein (GFP) and beta-glucuronidase (GUS) reporter genes. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2006;84:309-314. DOI: 10.1007/s11240-005-9039-1

30. Ramesh S. A., Kaiser B. N., Franks T., Collins G., Sedgley M. Improved methods in Agrobacterium-mediated transformation of almond using positive (mannose/pmi) or negative (kanamycin resistance) selection-based protocols. Plant Cell Rep. 2006;25:821- 828. DOI:10.1007/s00299-006-0139-0

31. Dai W., Magnusson V., Johnson C. AgrobacteriumMediated Transformation of Chokecherry (Prunus virginiana L.). HortScience. 2007;42:140-142.

32. Petri C., Wang H., Alburquerque N., Faize M., Burgos L. Agrobacterium-mediated transformation of apricot (Prunus armeniaca L.) leaf explants. Plant Cell Rep. 2008;27:1317-1324. DOI: 10.1007/s00299-008-0550-9

33. Liu X., Pijut P. M. Agrobacterium-mediated transformation of mature Prunus serotina (black cherry) and regeneration of transgenic shoots. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2010;101:49-57. DOI: 10.1007/s11240-009-9662-3

34. Urtubia C., Devia J., Castro Á., Zamora P., Aguirre C., Tapia, E., Barba P., Dell’Orto P., Moynihan M. R., Petri C. et al. Agrobacterium-mediated genetic transformation of Prunus salicina. Plant Cell Rep. 2008;27:1333-1340. DOI: 10.1007/s00299-008-0559-0

35. Tian L., Canli F. A., Wang X., Sibbald S. Genetic transformation of Prunus domestica L. using the hpt gene coding for hygromycin resistance as the selectable marker. Sci. Hortic. 2009;119:339-343.