Оценка влияния трансгенного компонента привойно-подвойной комбинации на устойчивость к вирусу шарки сливы

У косточковых плодовых культур устойчивость к вирусу шарки сливы (PPV) может быть достигнута за счет специфической деградации вирусной РНК по механизму РНК-интерференции (RNAi). Однако трансгенные устойчивые к вирусам растения вызывают серьезные опасения относительно биобезопасности из-за встраивания и экспрессии шпилечных конструкций, которые обычно содержат различные селективные чужеродные гены. Поскольку взрослое дерево плодовых культур представляет собой комбинацию привоя и подвоя, прививка коммерческих сортов на трансгенные устойчивые к вирусам подвои является возможным подходом для смягчения проблем биобезопасности. Настоящее исследование направлено на получения ответа на следующий вопрос: в какой степени сигналы сайленсинга малые интерферирующие РНК (siRNA) передаются из трансгенного подвоя в прививку коммерческого сорта и насколько это влияет на его устойчивость к PPV? Были изучены две комбинации, NT:GM и GM:NT (привой:подвой), с акцентом на первую комбинацию. Инокуляцию вирусом проводили либо на привое, либо на подвое. Форму клонового подвоя косточковых культур `Элита` [(Prunus pumila L..P. salicina Lindl.)x(P. cerasifera Ehrh.)] использовали в качестве подвоя для домашней сливы сорта Стартовая (Prunus domestica L.). Трансгенные формы как подвоя, так и привоя экспрессировали конструкцию РНК- шпильки, генерирующую малые интерферирующие РНК (siRNA) комплементарные гену белка оболочки PPV (CP), и демонстрировали высокую вирусную устойчивость. Данные о последовательностях пулов малых РНК (sRNA) показали, что накопление специфичной для конструкции малой интерферирующей (siRNA) в трансгенном подвое сливы достигло более 2 % от общего количества. Повышенный уровень siRNA обеспечивал устойчивость к PPV и блокировал перемещение вируса через GM-ткани к NT-партнеру при инокуляции трансгенных тканей. В то же время сигнал мобильной siRNA не перемещался от GM-подвоя к целевой NT-ткани привоя до уровня, достаточного для запуска сайленсинга транскриптов PPV и обеспечения надежной вирусной устойчивости. Отсутствие подвижности молекул siRNA, полученных из трансгена, сопровождалось переносом различных эндогенных специфичных для подвоя siRNA в NT-привой, что указывает на исключительное нарушение транзитивности исследуемого сигнала РНК интерференции. Представленные здесь результаты показывают, что трансплантация косточковых плодовых культур остается непредсказуемой практикой и требует дальнейшего изучения транспорта siRNA в комбинации подвой/привой на молекулярном уровне.

1. Warschefsky E. J., Klein L. L., Frank M. H., Chitwood D. H., Londo J. P., Wettberg E. J. B.von et al. Rootstocks: diversity, domestication, and impacts on shoot phenotypes. Trends Plant Sci. 2016;21:418-437. DOI:10.1016/j.tplants.2015.11.008

2. Rugini E., Silvestri C., Ceccarelli M., Muleo R. and Cristofori V. Mutagenesis and biotechnology techniques as tools for selecting new stable diploid and tetraploid olive genotypes and their dwarfi ng agronomical characterization. HortScience. 2016;51:799-804. DOI: 10.21273/HORTSCI.51.7.799

3. Albacete A., Martínez-Andújar C., Martínez-Pérez A., Th ompson A. J., Dodd I. C. and Pérez-Alfocea, F. Unravelling rootstock×scion interactions to improve food security. J. Exp. Bot. 2015;66:2211-2226. DOI: 10.1093/jxb/erv027

4. Lu X., Liu W., Wang T., Zhang J., Li X. and Zhang W. Systemic long-distance signaling and communication between rootstock and Scion in graft ed vegetables. Front. Plant Sci. 2020;11:460. DOI: 10.3389/fpls.2020.00460

5. Song G. -Q., Walworth A. E. and Loescher W. H. Graft ing of genetically engineered plants. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 2015;140: 203-213. DOI: 10.21273/JASHS.140.3.203

6. Lemgo G. N. Y., Sabbadini S., Pandolfi ni T. and Mezzetti B. Biosafety considerations of RNAi-mediated virus resistance in fruit-tree cultivars and in rootstock. Transgenic Res. 2013;22:1073- 1088. DOI: 10.1007/s11248-013-9728-1

7. Kyriacou M. C., Rouphael Y., Colla G., Zrenner R. and Schwarz D. Vegetable grafting: the implications of a growing agronomic imperative for vegetable fruit quality and nutritive value. Front. Plant Sci. 2017;8:741. DOI: 10.3389/fpls.2017.00741

8. Smolka A. Li X.-Y., Heikelt C., Welander M. and Zhu L.-H. Eff ects of transgenic rootstocks on growth and development of non-transgenic scion cultivars in apple. Transgenic Res. 2010;19:933-948. DOI: 10.1007/s11248-010-9370-0

9. Flachowsky H., Tränkner C., Szankowski I., Waidmann S., Hanke M.-V., Treutter D. et al. RNA-mediated gene silencing signals are not graft transmissible from the rootstock to the scion in greenhouse-grown apple plants Malus sp. Int. J. Mol. Sci. 2012;13:9992-10009. DOI: 10.3390/ijms13089992

10. Artlip T. S., Wisniewski M. E., Arora R. and Norelli J. L. An apple rootstock overexpressing a peach CBF gene alters growth and fl owering in the scion but does not impact cold hardiness or dormancy. Hortic Res. 2016;3:16006. DOI: 10.1038/hortres.2016.6

11. Zhao D. and Song G.-Q. Rootstock-to-scion transfer of transgene- derived small interfering RNAs and their eff ect on virus resistance in nontransgenic sweet cherry. Plant Biotechnol. J. 2014;12:1319-1328. DOI: 10.1111/pbi.12243

12. Rugini E., Silvestri C., Cristofori V., Brunori E. and Biasi R. Ten years fi eld trial observations of ri-TDNA cherry colt rootstocks and their effect on graft ed sweet cherry cv lapins. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2015;123:557-568. DOI: 10.1007/s11240-015-0860-x

13. Vigne E., Komar V. and Fuchs M. Field safety assessment of recombination in transgenic grapevines expressing the coat protein gene of grapevine fanleaf virus. Transgenic Res. 2004;13:165-179. DOI: 10.1023/B:TRAG.0000026075.79097.c9

14. Dandekar A. M., Jacobson A., Ibáñez A. M., Gouran H., Dolan D. L., Agüero C. B. et al. Trans-graft protection against Pierce’s disease mediated by transgenic grapevine rootstocks. Front. Plant Sci. 2019;10:84. DOI: 10.3389/fpls.2019.00084

15. Vahdati K., McKenna J. R., Dandekar A. M., Leslie C. A., Uratsu S. L., Hackett W. P. et al. Rooting and other characteristics of a transgenic walnut hybrid (Juglans hindsii×J. regia) rootstock expressing rolABC. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 2002;127:724-728. DOI: 10.21273/JASHS.127.5.724

16. Haroldsena, V. M., Chi-Hamb, C. L., and Bennett, A. B. (2012). Transgene mobilization and regulatory uncertainty for non-GE fruit products of transgenic rootstocks. J. Biotechnol. 161, 349–353. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2012.06.017

17. Liu X., Walawage S. L., Leslie C. A., Dandekar A. M., Tricoli D. M., Hu H. et al.. In vitro gene expression and mRNA translocation from transformed walnut (Juglans regia) rootstocks expressing DsRED fl uorescent protein to wild-type scions. Plant Cell Rep. 2017;36:877-885. DOI: 10.1007/s00299-017-2116-1

18. La Malfa S., Distefano G., Domina F., Nicolosi E., Toscano V. and Gentile A. Evaluation of citrus rootstock transgenic for rolABC genes. Acta Hortic. 2011;892:131-140. DOI: 10.17660/ActaHortic.2011.892.16

19. Song G.-Q., Walworth A., Lin T., Chen Q., Han X., Irina Zaharia L. et al. VcFT-induced mobile fl origenic signals in transgenic and transgraft ed blueberries. Hortic Res. 2019;6:105. DOI: 10.1038/s41438-019-0188-5

20. Agüero C. B., Uratsu S. L., Greve C., Powell A. L. T., Labavitch J. M., Meredith C. P. et al. Evaluation of tolerance to Pierce’s disease and Botrytis in transgenic plants of Vitis vinifera L. expressing the pear PGIP gene. Mol. Plant Pathol. 2005;6:43:51. DOI: 10.1111/j.1364-3703.2004.00262.x

21. Scorza R., Callahan A., Dardick C., Ravelonandro M., Polak J., Malinowski T. et al. Genetic engineering of Plum pox virus resistance: `HoneySweet` plum—from concept to product. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2013;115:1-12. DOI: 10.1007/s11240-013-0339-6

22. Khalid A., Zhang Q., Yasir M. and Li F. Small RNA based genetic engineering for plant viral resistance: application in crop protection. Front. Microbiol. 2017;8:43. DOI: 10.3389/fmicb.2017.00043

23. Limera C., Sabbadini S., Sweet J. B. and Mezzetti B. New biotechnological tools for the genetic improvement of major woody fruit species. Front. Plant Sci. 2017;8:1418. DOI: 10.3389/fpls.2017.01418

24. Ilardi V. and Tavazza M. Biotechnological strategies and tools for Plum pox virus resistance: trans-, intra-, cis-genesis, and beyond. Front. Plant Sci. 2015;6:379. DOI: 10.3389/fpls.2015.00379

25. Petri C., Alburquerque N., Faize M., Scorza R. and Dardick C. Current achievements and future directions in genetic engineering of European plum (Prunus domestica L.). Transgenic Res. 2018;27:225-240. DOI: 10.1007/s11248-018-0072-3

26. Kehr J. and Kragler F. Long distance RNA movement. New Phytol. 2018;218:29-40. DOI: 10.1111/nph.15025 28. Liu L. and Chen X. Intercellular and systemic traffi cking of RNAs in plants. Nat. Plants. 2018;4:869-878. DOI: 10.1038/s41477-018-0288-5

27. Choudhary S., Th akur S. and Bhardwaj P. Molecular basis of transitivity in plant RNA silencing. Mol. Biol. Rep. 2019;46:4645- 4660. DOI: 10.1007/s11033-019-04866-9

28. Zhang X. Lai, T. Zhang P., Zhang X., Yuan C., Jin Z. et al. Mini review: revisiting mobile RNA silencing in plants. Plant Sci. 2019;278:113-117. DOI: 10.1016/j.plantsci.2018.10.025

29. Pyott D. E. and Molnar A. Going mobile: non-cellautonomous small RNAs shape the genetic landscape of plants. Plant Biotechnol. J. 2015;13:306-318. DOI: 10.1111/pbi.12353

30. Kasai A., Sano T. and Harada T. Scion on a stock producing siRNAs of potato spindle tuber viroid (PSTVd) attenuates accumulation of the viroid. PLoS One. 2013;8:e57736. DOI: 10.1371/journal.pone.0057736

31. Md Ali E., Kobayashi K., Yamaoka N., Ishikawa M. and Nishiguchi M. Graft transmission of RNA silencing to nontransgenic scions for conferring virus resistance in tobacco. PLoS One. 2013;8:e63257. DOI: 10.1371/journal.pone.0063257

32. Dolgov S., Mikhaylov R., Serova T., Shulga O. and Firsov A. Pathogen-derived methods for improving resistance of transgenic plums (Prunus domestica L.) for Plum pox virus infection. Julius Kühn Arch. 2010;427:133-140.

33. Sidorova T., Mikhailov R., Pushin A., Miroshnichenko D. and Dolgov S. Agrobacterium-mediated transformation of Russian commercial plum cv. Startovaya (Prunus domestica L.) with virusderived hairpin RNA construct confers durable resistance to PPV infection in mature plants. Front. Plant Sci. 2019;10:286. DOI: 10.3389/fpls.2019.00286

34. Sidorova T., Pushin A., Miroshnichenko D. and Dolgov S. V. Generation of transgenic rootstock plum ((Prunus pumila L. ×P. salicina Lindl.)×(P. cerasifera Ehrh.)) using hairpin-RNA construct for resistance to the Plum pox virus. Agronomy. 2018;8:2. DOI: 10.3390/agronomy8010002

35. Sidorova T., Mikhailov R., Pushin A., Miroshnichenko D. and Dolgov S. V. A non-antibiotic selection strategy uses the phosphomannose-isomerase (PMI) gene and green fl uorescent protein (GFP) gene for Agrobacterium — mediated transformation of Prunus domestica L. leaf explants. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2017;128:197-209. DOI: 10.1007/s11240-016-1100-8

36. Menzel W., Jelkmann W. and Maiss E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplifi cation of plant mRNA as internal control. J. Virol. Methods. 2002;99:81-92. DOI: 10.1016/s0166-0934(01)00381-0

37. Chomczynski P. and Sacchi N. Th e single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction: twenty- something years on. Nat. Protoc. 2006;1:581-585. DOI: 10.1038/nprot.2006.83

38. Axtell M. J. ShortStack: comprehensive annotation and quantifi cation of small RNA genes. RNA. 2013;19:740-751. DOI: 10.1261/rna.035279.112

39. Quinlan A. R. BEDTools: the Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr. Protoc. Bioinform. 2014;47:11.12.1-11.12.34. DOI: 10.1002/0471250953.bi1112s47

40. Gu Z., Eils R. and Schlesner M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data . Bioinformatics . 2016; 32 : 2847-2849 . DOI: 10.1093/bioinformatics/btw313

41. Duan C.-G., Wang C.-H. and Guo H.-S. Application of RNA silencing to plant disease resistance. Silence. 2012;3:5. DOI: 10.1186/1758-907X-3-5

42. Zhao D., Zhong G.-Y. and Song G.-Q. Transfer of endogenous small RNAs between branches of scions and rootstocks in graft ed sweet cherry trees. PLoS. One 2020;15:e0236376. DOI: 10.1371/journal.pone.0236376

43. Nagel A. K., Kalariya H. and Schnabel G. Th e Gastrodia antifungal protein (GAFP-1) and its transcript are absent from scions of chimeric- graft ed plum. HortScience. 2010;45:188-192. DOI: 10.21273/HORTSCI.45.2.188

44. Tzean Y., Chang H.-H., Tu T.-C., Hou B.-H., Chen H.-M., Chiu Y.-S. et al. Engineering plant resistance to tomato yellow leaf curl Th ailand virus using a phloem-specifi c promoter expressing hairpin RNA. Mol. Plant- Microbe Interact. 2020;33:87-97. DOI: 10.1094/MPMI-06-19-0158-R

45. Wenzel S., Flachowsky H. and Hanke M. -V. Th e fast-track breeding approach can be improved by heat-induced expression of the FLOWERING LOCUS T genes from poplar (Populus trichocarpa) in apple (Malus×domestica Borkh.). Plant Cell Tissue Organ Cult. 2013;115:127-137. DOI: 10.1007/s11240-013-0346-7

46. Walworth A., Wickenheiser, R. and Song G. Rootstockspecific expression of VcFT in tobacco is insuffi cient to alter scion flowering regime. In vitro Cell Dev. Plant. 2014;50:521.

47. Bull S. E., Alder A., Barsan C., Kohler M., Hennig L., Gruissem W. et al. FLOWERING LOCUS T triggers early and fertile fl owering in glasshouse cassava (Manihot esculenta Crantz). Plan. Theory. 2017;6:22. DOI: 10.3390/plants6020022

48. Ye J., Geng Y., Zhang, B., Mao H., Qu J. and Chua N.-H. Th e Jatropha FT ortholog is a systemic signal regulating growth and fl owering time. Biotechnol. Biofuels. 2014;7:91. DOI: 10.1186/1754-6834-7-91

49. Yang Y., Mao L., Jittayasothorn Y., Kang Y., Jiao C., Fei Z. et al. Messenger RNA exchange between scions and rootstocks in graft ed grapevines.BMC Plant Biol. 2015;15:251. DOI: 10.1186/s12870-015-0626-y

50. Sarkies P., and Miska E. A. Small RNAs break out: the molecular cell biology of mobile small RNAs. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014;15:525-535. DOI: 10.1038/nrm3840

51. Devers E. A., Brosnan C. A., Sarazin A., Albertini D., Amsler A. C., Brioudes F. et al. Movement and differential consumption of short interfering RNA duplexes underlie mobile RNA interference. Nat. Plants 2020;6:789-799. DOI: 10.1038/s41477-020-0687-2

52. Schwab R. and Voinnet O. RNA silencing amplifi cation in plants: size matters. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010;107:14945- 14946. DOI: 10.1073/pnas.1009416107