Разработка методов регенерации и генетической трансформации сорта сливы Стартовая из соматических тканей

Разработана эффективная методика регенерации растений из соматических тканей культурных сортов сливы домашней (Prunus domestica L.), а также схемы селекции с использованием различных репортерных (uidA, gfp) и селективных маркерных генов (nptII, hpt). При трансформации соматических тканей сорта сливы получены трансгенные растения, содержащие как репортерные гены, так и гены хозяйственно-ценных признаков. Впервые было исследовано влияние кальция пантотената на адвентивную регенерацию побегов сливы. Показано, что селективный антибиотик гигромицин является более эффективным для отбора трансформантов сливы, чем канамицин или генетицин, что выразилось в более высокой частоте трансформации — 1,2-2,2 % против 0,2-0,5 % при селекции на канамицине. При использовании генетицина трансгенные растения получены не были. Оптимизация условий позволила увеличить процент регенерации побегов до 79,4 % для сорта Стартовая и до 39,6 % для сорта Этюд. Анализ экспрессии GFP в трансгенных линиях показал, что лидерные последовательности травянистых видов растений, кодирующие сигнальные пептиды, могут быть использованы для эффективной клеточной компартментализации продуктов экспрессии гетерологичных генов в сливе. Предварительные результаты также показывают более высокий уровень экспрессии ретикулярной формы GFP в сравнении с вакуолярной и цитозольной формами. Получены 9 трансгенных линий, содержащих вставку целевого гена bar, придающего устойчивость к фосфинотрицин-содержащим гербицидам типа «Basta», что подтвердилось наличием в геноме последовательности перенесенного гена и устойчивостью полученных трансгенных растений к 3-кратной полевой концентрации гербицида «Basta».

1. Scorza R. Gene transfer for the genetic improvement of perennial fruit and nut crops. HortScience. 1991;26:1033-1035.

2. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plantarum. 1962;15:473-497.

3. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. Acta Hortic. 1977;78:437-442.

4. Lloyd G., McCown L. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Comb. Proc. Int. Plant Prop. Soc. 1980;30:421-427.

5. Revenkova E. V., Kraev A. S., Skryabin K. G. Construction of a disarmed derivative of the supervirulent Ti plasmid pTiBo542. In: Skryabin K. G. (Ed.), Plant biotechnology and molecular biology. Pushchino Research Centre, Moscow, 1993, 67-76.

6. Hood E. E., Helmer W., Freley R. T., Chilton M. D. The hypervirulence of A.tumefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outside of T-DNA. J. Bact. 1986;168:1291-1301.

7. Lazo G. R., Stein P. A. & Ludwig R. A. A DNA transformation competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Bio/Technol. 1991;9:963-967.

8. Gomord V., Denmat L., Fitchettelaine A. The C-terminal HDEL sequence is sufficient for retention of secretory proteins in the endoplasmic reticulum (ER) but promotes vacuolar targeting of proteins that escape the ER. Plant J. 1997;11(2):313-325.

9. Падегимас Л., Шульга О. А., Скрябин К. Г. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solanum tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину. Молекулярная биология. 1994;28:437-443.

10. Velazhahan R., Cole K. C., Anuratha C. S., Muthukrishnan S. Induction of thaumatin-like proteins (TLPs) in Rhizoctonia solani — infected rice and characterization of two new cDNA clones. Physiol. Plant. 1998;102:21-28.

11. Jeff erson R. A., Kavanagh T. A., Bevan M. W. GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 1987;6:3901-3907.

12. Haseloff J., Siemering K. R., Prasher D. C., Hodge S. Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997;94:2122-2127.

13. Jacobini A., Standardi A. La moltiplicazione in vitro del melo cv. Wellspur. Rivista-dell’Ortoflorofrutticoltura-Italiana. 1982;66(3):217-229.

14. Плохинский Н. А. Биометрия. М.: Изд-во МГУ, 1970, 368 с.

15. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980, 293 с.

16. Mante S., Scorza R., Cordts J. M. Plant regeneration from cotyledons of Prunus persica, Prunus domestica, and Prunus cerasus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1989;19:1-11.

17. Mante S., Morgens P. H., Scorza R., Cordts J. M. and Callahan A. M. Agrobacterium-mediated transformation of plum (Prunus domestica L.) hypocotyl slices and regeneration of transgenic plants. Biotechnology 1991;9:853-857.