В последние годы вирус оспы сливы (Plum pox virus — PPV), вызывающий болезнь шарки сливы стал главной угрозой для выращивания косточковых культур. Этот вирус нанес огромный экономический ущерб и вызвал значительное снижение производственных площадей в странах Восточной Европы и Средиземноморья. Патоген распространился по всему миру и классифицирован карантинными службами растений как наиболее опасный для косточковых культур. К сожалению, в настоящее время наука не может предложить способы лечения вирусных заболеваний растений, поэтому уничтожение зараженных деревьев остается единственным способом сдерживания их распространения. Учитывая серьезность заболевания, трудность контроля над его распространением, отсутствие устойчивых к нему существующих сортов, очевидна необходимость создания гибридов с повышенной устойчивостью к этому патогену. Современные методы генной инженерии дают возможность значительно ускорить процессы создания высокопродуктивных сортов сливы с повышенной или полной устойчивостью к вирусам, недостижимые методами традиционной селекции. Большинство известных работ модификации геномов косточковых плодовых культур выполнено с использованием ювенильного материала зиготического происхождения, имеющих более высокий морфогенетический потенциал по сравнению с сортами. Применение современных биоинженерных приемов в селекции косточковых культур тормозится отсутствием отработанных методик, способных обеспечить достаточно высокую частоту регенерации побегов из соматических тканей. Эти и другие причины вызывают необходимость разработки эффективной генотип-независимой системы регенерации и модификации геномов коммерческих сортов сливы. Принимая во внимание быстрое развитие методов редактирования генома растений, целевая мутация генов-хозяев, вовлеченных в репликацию, и широкое распространение PPV в инфицированных тканях, может быть многообещающим подходом для инженерии устойчивости к вирусам, исключающим введение чужеродных последовательностей в геном сливы.

Разработана эффективная методика регенерации растений из соматических тканей культурных сортов сливы домашней (Prunus domestica L.), а также схемы селекции с использованием различных репортерных (uidA, gfp) и селективных маркерных генов (nptII, hpt). При трансформации соматических тканей сорта сливы получены трансгенные растения, содержащие как репортерные гены, так и гены хозяйственно-ценных признаков. Впервые было исследовано влияние кальция пантотената на адвентивную регенерацию побегов сливы. Показано, что селективный антибиотик гигромицин является более эффективным для отбора трансформантов сливы, чем канамицин или генетицин, что выразилось в более высокой частоте трансформации — 1,2-2,2 % против 0,2-0,5 % при селекции на канамицине. При использовании генетицина трансгенные растения получены не были. Оптимизация условий позволила увеличить процент регенерации побегов до 79,4 % для сорта Стартовая и до 39,6 % для сорта Этюд. Анализ экспрессии GFP в трансгенных линиях показал, что лидерные последовательности травянистых видов растений, кодирующие сигнальные пептиды, могут быть использованы для эффективной клеточной компартментализации продуктов экспрессии гетерологичных генов в сливе. Предварительные результаты также показывают более высокий уровень экспрессии ретикулярной формы GFP в сравнении с вакуолярной и цитозольной формами. Получены 9 трансгенных линий, содержащих вставку целевого гена bar, придающего устойчивость к фосфинотрицин-содержащим гербицидам типа «Basta», что подтвердилось наличием в геноме последовательности перенесенного гена и устойчивостью полученных трансгенных растений к 3-кратной полевой концентрации гербицида «Basta».

Для формы карликового зимостойкого клонового подвоя косточковых культур 146-2 (Prunus pumila L.xP. tomentosa Thunb.), разработана система регенерации и генетической трансформации с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP). Для эффективной регенерации придаточных побегов не требовалось предварительной обработки 6-бензиламино-пурином (BA) и ауксином. Стимуляции регенерации побегов из эксплантов листьев требовала 2-3 недели темного периода. Наилучшая регенерация (более 75 %) наблюдалась при комбинации фитогормонов 3 мг/л BA и 0,75 мг/л IBA. Достигнутая эффективность регенерации позволила разработать протокол генетической трансформации, опосредованной Agrobacterium, для подвоя 146-2. Целые листья из культивированных in vitro побегов использовали в качестве эксплантов для трансформации штаммом A. tumefaciens CBE21, с бинарным вектором pBINmGFP5ER, содержащим ген nptII, кодирующий неомицинфосфотрансферазу II в качестве селектируемого для растений маркера под контролем промотора NOS (нопалинсинтазы) и репортерного гена gfp, кодирующего зеленый флуоресцентный белок под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (Caulifl ower mosaic virus) (CaMV). Интеграцию nptII и gfp в трансгены подтверждали с помощью ПЦР. Экспрессию зеленого флуоресцентного белка наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии. Эффективность трансформации на основе анализа ПЦР независимых линий, устойчивых к канамицину, составила 0,41-0,83 %. Все трансгенные линии показали устойчивость к канамицину при концентрации 40 мг/л. Они были укоренены и акклиматизированы к тепличным условиям. Разработанные протоколы будут использоваться для получения устойчивых к вирусу шарки сливы (PPV) растений.

В настоящее время наиболее опасным патогеном абрикосов, слив и персиков считается вирус оспы сливы (PPV), возбудитель болезни шарки сливы. Трансформация сливы вирусными генами, такими как белок оболочки, может обеспечить получение устойчивых к вирусам сортов и исходных форм для использования в селекционном процессе. Для повышения устойчивости растений к вирусу шарки сливы (PPV) использовали две технологии. Одна основана на совместном подавлении, а другая — на РНК-сайленсинге (RNAi). Бинарный вектор pCamPPVcp, который содержал селективный ген hpt и ген белка оболочки вируса шарки сливы ppvcp в смысловой ориентации (управляемый двойным промотором 35S), был использован для реализации посттранскрипционного сайленсинга гена. Вектор pCamPPVRNAi содержал самокомплементарные фрагменты гена ppv-cp (698 пар оснований), управляемые двойным промотором 35S и генами hpt и gus. Фрагменты гена ppv-cp были разделены pdk-интроном для получения структуры РНК «шпильки» в антисмысловой ориентации. Были получены семь независимых трансгенных линий с геном ppv-cp и пять трансгенных линий с двумя инвертированными повторами фрагмента гена ppv-cp. Стабильная интеграция генов в геном растений подтверждена ПЦР-анализами. Накопление белка оболочки оценивали методом вестерн-блоттинга в пяти из шести проанализированных линий. Трансгенные побеги были укоренены и акклиматизированы в теплице. После прививки инфицированными PPV почками у всех контрольных и трансформированных ppv-cp растений с помощью вестерн-блоттинга обнаруживались полосы, соответствующие белку оболочки PPV, тогда как в образцах от растений, трансформированных конструкцией «шпилька», не наблюдалось никаких пятен, соответствующих белку оболочки PPV. Эти предварительные результаты подтвердили эффективность стратегии RNAi для защиты растений от вирусной атаки в целом и плодов косточковых культур и от PPV, в частности.

В современном садоводстве вирус шарки сливы (PPV) представляет серьезную угрозу для товарных плантаций широкого спектра культур, принадлежащих к роду Prunus. Учитывая отсутствие природных генетических источников, которые обеспечивают надежную устойчивость к инфекции PPV, представляет значительный интерес использование методов биоинженерии для целевой модификации генома косточковых плодовых культур в целях борьбы с болезнью шарки, вызываемой PPV. Рядом исследований показано, что интерференция РНК является наиболее многообещающей стратегией борьбы с вирусными заболеваниями растений. В настоящем исследовании описано получение устойчивой к PPV сливы домашней сорта Стартовая (P. domestica L.) посредством опосредованной агробактериями (Agrobacterium-mediated) трансформации листовых эксплантов in vitro. Благодаря органогенезу из листьев, разработанный протокол позволяет проводить модификацию генома сливы без потери фенотипического соответствия исходному сорту. В результате исследований получено семь независимых линий сливы, содержащих самокомплементарные фрагменты последовательности гена PPV-CP, разделенные интроном PDK картофеля, с использованием гена устойчивости к гигромицину hpt в качестве селективного гена и β-глюкуронидазы uidA в качестве репортерного гена. Трансформацию подтверждали гистохимическим окрашиванием на активность β-глюкуронидазы, ПЦР-амплификацией соответствующих продуктов из выделенной геномной ДНК и саузерн-блотанализом шпилечных фрагментов гена PPV-CP. Для выяснения устойчивости к вирусу почки сливы, инфицированные штаммом PPV-M, прививали на однолетние трансгенные растения, которые в дальнейшем культивировали в теплице. Согласно оценке с помощью RT-PCR, DAS-ELISA, вестерн-блоттинга, теста ImmunoStrip а также визуальных наблюдений, деревья GM сливы оставались незараженными в течение 9 лет. Зараженные ветви, которые развились из привитых почек, на протяжении многих лет проявляли очевидные симптомы болезни шарки и сохраняли высокий уровень накопления вируса, в результате чего трансгенные деревья-хозяева постоянно подвергались инфекционному давлению. Стабильная экспрессия производной от PPV генной конструкции, кодирующей сплайсированные интронами шпилечные РНК, обеспечивала высокоэффективную защиту сливовых деревьев от перманентной вирусной инфекции. В то же время это наблюдение указывает на отсутствие системного распространения устойчивости от ГМ-тканей к инфицированному транспланту сливы даже после нескольких лет совместного роста.