Генетическая трансформация формы клонового подвоя косточковых культур 146-2 с использованием репортерного гена зеленого флуоресцентного белка

Для формы карликового зимостойкого клонового подвоя косточковых культур 146-2 (Prunus pumila L.xP. tomentosa Thunb.), разработана система регенерации и генетической трансформации с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP). Для эффективной регенерации придаточных побегов не требовалось предварительной обработки 6-бензиламино-пурином (BA) и ауксином. Стимуляции регенерации побегов из эксплантов листьев требовала 2-3 недели темного периода. Наилучшая регенерация (более 75 %) наблюдалась при комбинации фитогормонов 3 мг/л BA и 0,75 мг/л IBA. Достигнутая эффективность регенерации позволила разработать протокол генетической трансформации, опосредованной Agrobacterium, для подвоя 146-2. Целые листья из культивированных in vitro побегов использовали в качестве эксплантов для трансформации штаммом A. tumefaciens CBE21, с бинарным вектором pBINmGFP5ER, содержащим ген nptII, кодирующий неомицинфосфотрансферазу II в качестве селектируемого для растений маркера под контролем промотора NOS (нопалинсинтазы) и репортерного гена gfp, кодирующего зеленый флуоресцентный белок под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (Caulifl ower mosaic virus) (CaMV). Интеграцию nptII и gfp в трансгены подтверждали с помощью ПЦР. Экспрессию зеленого флуоресцентного белка наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии. Эффективность трансформации на основе анализа ПЦР независимых линий, устойчивых к канамицину, составила 0,41-0,83 %. Все трансгенные линии показали устойчивость к канамицину при концентрации 40 мг/л. Они были укоренены и акклиматизированы к тепличным условиям. Разработанные протоколы будут использоваться для получения устойчивых к вирусу шарки сливы (PPV) растений.

1. Warschefsky E. J., Klein L. L., Frank M. H., Chitwood D. H., Londo J. P., von Wettberg E. J. B. and Miller A. J. Rootstocks: diversity, domestication, and impacts on shoot phenotypes. Trends Plant Sci. 2016;21(5):418-437. DOI:10.1016/j.tplants.2015.11.008. PubMed

2. Machado A. C., Katinger H., and Machado M. Coat protein-mediated protection against plum pox virus in herbaceous model plants and transformation of apricot and plum. Euphytica. 1994;77(1-2):129-134. DOI:10.1007/BF02551475

3. Ravelonandro M., Scorza R., Bachelier J. C., Labonne G., Levy L., Damsteegt V., Callahan A. and Dunez J. Resistance of transgenic Prunus domestica to Plum pox virus infection. Plant Dis. 1997;81(11):1231-1235. DOI:10.1094/PDIS.1997.81.11.1231

4. Ravelonandro M., Briard P., Hily J. M., Scorza R., and Lomberk D. Evaluation of Plum pox virus (PPV) CP and P1 constructs on sharka resistance in plum (Prunus domestica). Acta Hortic. 2015;1063:63-70. DOI:10.17660/ActaHortic.2015.1063.7

5. Kundu J. K., Briard P., Hily J. M., Ravelonandro M. and Scorza R. Role of the 25-26 nt siRNA in the resistance of transgenic Prunus domestica graft inoculated with Plum pox virus. Virus Genes. 2008;36(1):215-220. DOI:10.1007/s11262-007-0176-y. PubMed

6. Scorza R., Callahan A., Dardick C., Ravelonandro M., Polak J., Malinowski T., Zagrai I., Cambra M. and Kamenova I. Genetic engineering of Plum pox virus resistance: ‘Honey Sweet’ plum — from concept to product. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2013;115(1):1-12. DOI:10.1007/s11240-013-0339-6.

7. Cambra M., Capote N., Myrta A., and Llacer G. Plum pox virus and the estimated costs associated with sharka disease. Bull. OEPP. 2006;36(2):202-204. DOI:10.1111/j.1365-2338.2006.01027.x.

8. Milusheva S. and Bozhkova V. Reaction of six Prunus rootstocks to Plum pox virus in Plovdiv, Bulgaria. Acta Hortic. 2015;1063:111-116. DOI:10.17660/ActaHortic.2015.1063.15

9. James D., Varga, A. and Sanderson D. Genetic diversity of Plum pox virus: strains, disease and related challenges for control. Can. J. Plant Pathol. 2013;35(4):431-441. DOI:10.1080/0706066 1.2013.828100.

10. Petri C., Alburquerque N., Faize M., Scorza R. and Dardick C. Current achievements and future directions in genetic engineering of European plum (Prunus domestica L.). Transgenic Res. 2018;27(3):225–240. DOI:10.1007/s11248-018-0072-3. PubMed

11. Murashige T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962;15(3):473-497. DOI:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.

12. Quoirin M. and Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus spp. Acta Hortic. 1977;78:437-442. DOI:10.17660/ActaHortic.1977.78.54.

13. Driver J. A. and Kuniyuki A. H. In vitro propagation of Paradox walnut rootstocks. HortScience. 1984;19:507-509.

14. Pascual L. and Marı́n J.A. A liquid 2,4-D pulse increased shoot and root regeneration from leaf explants of adult Prunus rootstocks. Sci. Hortic. (Amsterdam). 2005;106(4):582–592. DOI:10.1016/j.scienta. 2005.04.010.

15. Jacobini A., Standardi A. La moltiplicazione “in vitro” del melo cv. Wellspur. Riv. Ortoflorofruttic. Ital. 1982;66:217-229.

16. Revenkova E. V., Kraev A. S., Skryabin K. G. Construction of a disarmed derivative of the supervirulent Ti plasmid pTiBo542. In: Skryabin K. G. (Ed.), Plant biotechnology and molecular biology. Pushchino Research Centre, Moscow, 1993, 67-76.

17. Pé rez-Tornero O., Egea J., Vanoostende A. and Burgos L. Assessment of factors aff ecting adventitious shoot regeneration from in vitro cultured leaves of apricot. Plant Sci. 2000;158 (1-2):61-70. DOI:10.1016/S0168-9452(00)00303-4. PubMed

18. Burgos L., and Alburquerque N. Ethylene inhibitors and low kanamycin concentrations improve adventitious regeneration from apricot leaves. Plant Cell Rep. 2003;21(12):1167-1174. DOI:10.1007/s00299-003-0625-6. PubMed

19. Mikhailov R. V., Muratova S. A. and Dolgov S. V. Production of transgenic plum plants from vegetative tissues by means of positive selection. Acta Hortic. 2007;734:129-138. DOI:10.17660/ActaHortic. 2007.734.15.

20. Petri C. and Scorza R. Factors affecting adventitious regeneration from in vitro leaf explants of ‘Improved French’ plum, the most important dried plum cultivar in the USA. Ann. Appl. Biol. 2010;156(1):79-89. DOI:10.1111/j.1744-7348.2009.00364.x.

21. Pé rez-Tornero O. and Burgos L. Apricot micropropagation. In Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits, S. M. Jain, and H. Häggman, eds. (Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag), 2007, 267-278. DOI:10.1007/978-1-4020-6352-7_25.

22. Petri C. and Burgos S. Transformation of fruit trees. Useful breeding tool or continued future prospect? Transgenic Research 2005;14(1):15-26. DOI:10.1007/s11248-004-2770-2.

23. Dolgov S. V. Genetic transformation of sour cherry (Cerasus vulgaris Mill.). In Biotechnology in Agriculture and Forestry. 2000;44:29-38. DOI:10.1007/978-3-642-59609-4_3.

24. Mikhailov R. V., Muratova S. A. and Dolgov S. V. Production of transgenic plum plants from vegetative tissues by means of positive selection. Acta Hortic. 2007;734:129-138. DOI:10.17660/ActaHortic. 2007.734.15.

25. Petri C. and Scorza R. Factors affecting adventitious regeneration from in vitro leaf explants of ‘Improved French’ plum, the most important dried plum cultivar in the USA. Ann. Appl. Biol. 2010;156(1):79-89. DOI:10.1111/j.1744-7348.2009.00364.x.

26. Pé rez-Tornero O. and Burgos L. Apricot micropropagation. In Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits, S. M. Jain, and H. Häggman, eds. (Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag), 2007, 267-278. DOI:10.1007/978-1-4020-6352-7_25.

27. Sidorova T., Mikhailov R., Pushin A., Miroshnichenko D. and Dolgov S. A non-antibiotic selection strategy uses the phosphomannose-isomerase (PMI) gene and green fluorescent protein (GFP) gene for Agrobacterium-mediated transformation of Prunus domestica L. leaf explants. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2017;128(1):197-209 DOI:10.1007/s11240-016-1100-8