Использование подвоев сливы, устойчивых к потивирусу шарки сливы (PPV), является важной стратегией борьбы с распространением заболевания в питомниках и садах. Несмотря на значительный прогресс в разработки подвоев косточковых плодовых культур для адаптации к различным стрессам, долговременная устойчивость к вирусам традиционными методами селекции до сих пор безуспешна. По этой причине создание устойчивых к PPV растений биоинженерными методами остается актуальной в противодействии распространению этого заболевания. Целью настоящего исследования является получение трансгенных растений клонового подвоя косточковых культур `Элита`, устойчивого к PPV, с использованием технологии интерференции рибонуклеиновых кислот (RNAi). Для индуцирования механизма посттранскрипционного замалчивания экспресии генов, обеспечивающий устойчивость к вирусу, была использована генетическая конструкция, содержащая самокомплементарные фрагменты последовательности гена белка оболочки вируса шарки сливы (PPV-CP). Трансгенные растения были получены после опосредованной агробактериями трансформации листьев in vitro. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) и Саузерн-блоттинга подтвердили стабильную геномную интеграцию последовательности PPV-CP смысловой и антисмысловой интрон-РНК-шпильки последовательности. Функциональность введенной экспрессионной кассеты была подтверждена активностью включения гена uidA в переносящую Т-ДНК. Насколько нам известно, это первый межвидовой подвой сливы, полученный с помощью генной инженерии для достижения устойчивости к PPV.

У косточковых плодовых культур устойчивость к вирусу шарки сливы (PPV) может быть достигнута за счет специфической деградации вирусной РНК по механизму РНК-интерференции (RNAi). Однако трансгенные устойчивые к вирусам растения вызывают серьезные опасения относительно биобезопасности из-за встраивания и экспрессии шпилечных конструкций, которые обычно содержат различные селективные чужеродные гены. Поскольку взрослое дерево плодовых культур представляет собой комбинацию привоя и подвоя, прививка коммерческих сортов на трансгенные устойчивые к вирусам подвои является возможным подходом для смягчения проблем биобезопасности. Настоящее исследование направлено на получения ответа на следующий вопрос: в какой степени сигналы сайленсинга малые интерферирующие РНК (siRNA) передаются из трансгенного подвоя в прививку коммерческого сорта и насколько это влияет на его устойчивость к PPV? Были изучены две комбинации, NT:GM и GM:NT (привой:подвой), с акцентом на первую комбинацию. Инокуляцию вирусом проводили либо на привое, либо на подвое. Форму клонового подвоя косточковых культур `Элита` [(Prunus pumila L..P. salicina Lindl.)x(P. cerasifera Ehrh.)] использовали в качестве подвоя для домашней сливы сорта Стартовая (Prunus domestica L.). Трансгенные формы как подвоя, так и привоя экспрессировали конструкцию РНК- шпильки, генерирующую малые интерферирующие РНК (siRNA) комплементарные гену белка оболочки PPV (CP), и демонстрировали высокую вирусную устойчивость. Данные о последовательностях пулов малых РНК (sRNA) показали, что накопление специфичной для конструкции малой интерферирующей (siRNA) в трансгенном подвое сливы достигло более 2 % от общего количества. Повышенный уровень siRNA обеспечивал устойчивость к PPV и блокировал перемещение вируса через GM-ткани к NT-партнеру при инокуляции трансгенных тканей. В то же время сигнал мобильной siRNA не перемещался от GM-подвоя к целевой NT-ткани привоя до уровня, достаточного для запуска сайленсинга транскриптов PPV и обеспечения надежной вирусной устойчивости. Отсутствие подвижности молекул siRNA, полученных из трансгена, сопровождалось переносом различных эндогенных специфичных для подвоя siRNA в NT-привой, что указывает на исключительное нарушение транзитивности исследуемого сигнала РНК интерференции. Представленные здесь результаты показывают, что трансплантация косточковых плодовых культур остается непредсказуемой практикой и требует дальнейшего изучения транспорта siRNA в комбинации подвой/привой на молекулярном уровне.

Нами разработана эффективная система агробактериальной трансформации эксплантов листьев сливы (Prunus domestica L.) с использованием системы селекции PMI/манноза и GFP. Сорт Стартовая был трансформирован с использованием штамма Agrobacterium tumefaciens CBE21, несущего вектор pNOV35SGFP. Экспланты листьев помещали в питательную среду, содержащую различные концентрации и комбинации маннозы и сахарозы, чтобы разработать эффективную систему селекции. Девять независимых трансгенных линий растений сливы были получены на регенерационной среде, содержащей 20 г/л сахарозы и 15 г/л маннозы. Самая высокая частота трансформации (1,40 %) была получена с использованием стратегии отложенной селекции. Начиная с первых суток после трансформации и заканчивая регенерацией побегов из трансгенного каллуса, отбор трансгенных клеток контролировали по флуоресценции GFP, что позволяло избежать образования нетрансгенных побегов. Интеграцию трансгенов manA и gfp подтверждали с помощью ПЦР и саузерн-блоттинга. В настоящем исследовании не было обнаружено прямой корреляции между уровнем флуоресценции и числом копий трансгенов, хотя наиболее интенсивная флуоресценция наблюдалась в линии № 9 с однокопийной вставкой. Разница в уровне экспрессии GFP могла быть вызвана сайтом интеграции или другими факторами, такими как метилирование ДНК и варьирующееся количество копий. Описанный протокол трансформации с использованием системы PMI/маннозы является альтернативной системой селекции для получения трансгенных растений сливы без генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам, а использование листовых эксплантов позволяет сохранить культурные признаки растений сливы.

Для получения устойчивых к вирусу шарки сливы (PPV) растений клонового подвоя 146-2 и промышленного сорта Стартовая использовался метод РНК-интерференционного сайленсинга генов. Для этого был создан вектор с самокомплементарными последовательностями фрагмента генов eIF (iso)4G и eIF(iso)E длиной 578 п.н. Гены eIF (iso)4G и eIF(iso)E кодируют факторы инициации трансляции, участвующие в жизненном цикле вируса шарки сливы. Для управления экспрессией шпильки был выбран сильный промотор гена рибулозо- 1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCo) в полном и укороченном вариантах. Успешная генетическая трансформация была проведена штаммом A. tumefaciens CBE21. В качестве источника эксплантата использовали целые листья побегов, культивируемых in vitro. Гены nptII и hpt, кодирующие неомицин II и гигромицин фосфотрансферазы, были использованы в качестве селектируемых маркеров растений. В наших экспериментах получено 5 независимых трансгенных линий подвоя 146-2 и сорта Стартовая, акклиматизированных в тепличных условиях. Их статус подтвержден ПЦР и Саузерн-блоттингом. Эффективность трансформации составила 0,3-0,4 %. Полученные растения были инфицированные PPV методом окулировки зараженных почек, устойчивость полученных растений оценивалась методом ELISA. Использование полноразмерного промотора гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы (RBCS) при трансформации растений сорта Стартовая приводило к понижению жизнеспособности растений в случае супрессии гена eIF(iso)4E и обеспечивало устойчивость по крайней мере в первый год после инокуляции в случае супрессии гена eIF(iso)4G.